Efecto inhibitorio de la luz láser de 405 nm sobre el biofilm bacteriano en el stent uretral

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 3908 (2023) Citar este artículo

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El uso clínico de los stents uretrales suele complicarse por diversos efectos adversos, como disuria, fiebre e infección del tracto urinario (ITU). Las biopelículas (formadas por bacterias, como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus) que se adhieren al stent causan infecciones urinarias en pacientes con stent (aproximadamente el 11 %). Las consecuencias indeseables del uso de antibióticos incluyen resistencia bacteriana, aumento de peso y diabetes tipo 1, que ocurren cuando los antibióticos se usan durante mucho tiempo. Nuestro objetivo fue evaluar la eficacia de un nuevo tratamiento óptico con un láser de 405 nm para inhibir el crecimiento bacteriano en un stent uretral in vitro. El stent uretral se cultivó en medio de caldo de S. aureus durante tres días para inducir la formación de biopelículas en condiciones dinámicas. Se probaron varios tiempos de irradiación con la luz láser de 405 nm (5, 10 y 15 min). Se evaluó cuantitativa y cualitativamente la eficacia del tratamiento óptico sobre biopelículas. La producción de especies reactivas de oxígeno ayudó a eliminar la biopelícula sobre el stent uretral después de la irradiación de 405 nm. La tasa de inhibición correspondió a una reducción logarítmica de 2,2 unidades formadoras de colonias/mL de bacterias después de 0,3 W/cm2 de irradiación durante 10 min. El stent tratado mostró una reducción significativa en la formación de biopelículas en comparación con el stent no tratado, como lo demuestra SYTO 9 y la tinción con yoduro de propidio. Los ensayos de MTT que utilizan la línea celular CCD-986sk no revelaron toxicidad después de 10 minutos de irradiación. Llegamos a la conclusión de que el tratamiento óptico con luz láser de 405 nm inhibe el crecimiento bacteriano en los stents uretrales con toxicidad mínima o nula.

Los stents uretrales (US) se usan para tratar la obstrucción de la salida de la vejiga causada por diversas enfermedades. La estenosis uretral, la hiperplasia prostática benigna (HPB) y la disinergia del esfínter detrusor (DSD) son indicaciones para la inserción de ecografía en pacientes elegibles1. Por lo general, el US está construido con una aleación de metal (nitinol), materiales poliméricos o material biodegradable que es lo suficientemente resistente para mantener la permeabilidad de la uretra. Culha et al. han informado una eficacia a largo plazo de los EE. UU. del 63 % en pacientes con estenosis uretrales recurrentes2. Por lo tanto, el resultado fallido de la inserción del stent, como la migración del stent, la incrustación, la infección urinaria crónica, el dolor uretral y la reestenosis, son las complicaciones de la colocación del stent3. Riedl et al. descubrió que todos los pacientes con stents permanentes crónicos tienen colonización del stent y bacteriuria. Los stents temporales también están ampliamente colonizados, con una tasa de ocurrencia del 69%, y el 45% de los pacientes están afectados por bacteriuria; tal colonización microbiana causa UTI4. Las infecciones urinarias son causadas por bacterias grampositivas y negativas, como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterococcus faecalis y Staphylococcus aureus (S. aureus), y ciertos hongos5.

La infección urinaria puede ocurrir cuando se implanta US estéril en el cuerpo humano. Biopelícula se refiere a una acumulación de bacterias y sus subproductos extracelulares que forman una comunidad organizada en la superficie6. El crecimiento de biopelículas afecta significativamente a los objetos o equipos extraños implantados en el cuerpo humano. En las últimas décadas se ha desarrollado una amplia gama de cuerpos extraños, como US, dispositivos implantables, cabestrillo, para aplicaciones urológicas6. Por lo tanto, en la superficie de un implante, las biopelículas están altamente estructuradas y comprenden poblaciones de bacterias, proteínas y polímeros extracelulares en crecimiento activo. El aumento de la formación de biopelículas puede provocar resistencia bacteriana a los antibióticos e infecciones crónicas7.

Actualmente, los antibióticos y los recubrimientos superficiales de los stents se utilizan para prevenir las infecciones urinarias8. Aunque la mayoría de los antibióticos son comunes, algunos antimicrobianos tienen efectos secundarios potenciales si se usan durante un período prolongado9. Los riesgos del uso de antibióticos incluyen resistencia bacteriana, obesidad y diabetes10. Los efectos adversos del uso de antibióticos pueden incluir malabsorción que da como resultado una enfermedad celíaca, reducción de la absorción de medicamentos, alteración del metabolismo y absorción de vitaminas, colonización por organismos resistentes y alteración de la susceptibilidad a las infecciones11. La aplicación de láser para la inhibición bacteriana a través de fibras ópticas está ganando atención como método alternativo para abordar estos problemas12,13.

Se puede aplicar una amplia gama de longitudes de onda (de 400 a 1000 nm), y entre las longitudes de onda, la luz azul ha demostrado ser efectiva para reducir la viabilidad de una variedad de especies bacterianas, incluidas S. aureus resistente a la meticilina (MRSA), Helicobacter pylori , Porphyromonas gingivalis y Pseudomonas aeruginosa, mientras que la mayoría de los espectros con alta irradiancia pueden matar bacterias por efecto fototérmico incluso con baja irradiancia14,15. Otra fuente de láser, tal como la luz ultravioleta (UV), también es reconocida como bactericida. Sin embargo, debido a los efectos citotóxicos en el tejido de los mamíferos, el uso in vivo de la luz ultravioleta está restringido16. Dai, et al. descubrió una pérdida del 57 % de queratinocitos cuando investigaba la terapia con luz ultravioleta para las infecciones de la vía central14. Esta citotoxicidad indica que, a pesar de ser un agente antimicrobiano eficaz, la aplicación de la luz ultravioleta puede no ser la opción ideal para los tejidos vivos17. Así, la luz láser de 405 nm (luz azul) ha sido ampliamente utilizada para la desinfección bacteriana18,19. Maclean et al. coincidieron en que el daño oxidativo de las bacterias y la fotoexcitación de las porfirinas en la longitud de onda de 405 nm podrían generar la mayor actividad germicida20,21. Además, las porfirinas y otras sustancias fotoactivas pueden descontaminar bacterias al generar especies reactivas de oxígeno (ROS) como resultado de la absorción de la luz de 405 nm. ROS es una clase de radicales libres que comprende oxígeno singulete, anión superóxido, peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo. Durante la citotoxicidad bacteriana, bajo la exposición a la luz violeta-azul (405 nm), las moléculas fotosensibilizadoras endógenas (porfirinas) se fotoexcitan y generan ROS. La producción suficiente de ROS conduce a la lisis celular a través del estrés oxidativo. En general, la producción de ROS en bacterias implica dos vías durante la terapia fotodinámica (TFD): tipo 1 y tipo 2. En el tipo 1, la porfirina endógena reacciona directamente con los componentes celulares, incluidas las proteínas, los lípidos, los ácidos nucleicos y otras micromoléculas. , para generar anión superóxido y radical hidroxilo, que, a su vez, conduce a la producción de otras moléculas ROS. En el tipo 2, la porfirina se une al oxígeno molecular para formar oxígeno singulete. Este mecanismo conduce posteriormente al daño oxidativo de las células bacterianas expuestas a la luz y provoca la muerte celular21,22. Se ha informado que otros mecanismos, como la interrupción de las membranas bacterianas y el daño del ADN, son los efectos de la luz azul23.

Aunque se han utilizado antibióticos para tratar las infecciones urinarias, la medicación actual todavía está asociada con varios efectos secundarios, como la obesidad y la resistencia bacteriana. El objetivo del presente estudio fue examinar un tratamiento alternativo para la UTI mediante la irradiación de luz láser sobre la biopelícula bacteriana cultivada en EE. UU. a través de un dispositivo óptico. Se planteó la hipótesis de que el uso de luz láser de 405 nm podría inhibir el biofilm bacteriano como fototerapia en pacientes con stent para prevenir las infecciones urinarias. Este estudio in vitro fue diseñado como una investigación de primera etapa para el tratamiento alternativo de las infecciones urinarias. Se utilizó un láser de 405 nm de un dispositivo óptico integrado en una cesta para enviar luz a la superficie interior de los EE. UU. Para las evaluaciones de seguridad, se utilizaron ensayos MTT para evaluar el efecto de la luz láser de 405 nm como agente fototerapéutico para inhibir la formación de biopelículas bacterianas en líneas celulares humanas. El tratamiento óptico propuesto puede ser un tratamiento alternativo viable para la infección bacteriana en pacientes con stent.

La condición del cultivo bacteriano en los EE. UU. se analizó utilizando el método de tinción CV para estimar la aproximación de la viabilidad bacteriana durante el tiempo de cultivo. Cada día ofrece diferentes formaciones de biopelículas, según la Fig. 1a (cultivo de 0 a 3 días). La tinción de CV funcionó como un tinte intercalante, que se utiliza para la visualización rápida de biopelículas, y la tinción permitió la cuantificación de células, como se muestra en la Fig. 1b. La estimación de la formación de biopelículas en el día 3 alcanzó más del 80 %, en comparación con el día 0.

Crecimiento de biopelícula bacteriana: (a) stents uretrales teñidos con cristal violeta en varios puntos de tiempo después del cultivo y (b) viabilidad bacteriana versus tiempo de cultivo.

Se llevó a cabo un experimento MTT para evaluar la viabilidad celular en entornos de tratamiento previo y posterior para seleccionar un método alternativo para eliminar la biopelícula bacteriana de los EE. UU. con luz láser de 405 nm. Las células tratadas mostraron una disminución de la viabilidad celular del 2 % (5 min), 4 % (10 min) y 10 % (15 min) después de 24 h de incubación, en comparación con el control (p < 0,05). Los resultados del ensayo MTT demostraron que la irradiación láser de 15 min causó un efecto tóxico en las células, lo que llevó a una reducción de células de más del 10 % (Fig. 2a). El desarrollo de la temperatura en la Fig. 2b demuestra que el máximo alcanzó una temperatura de 32 °C para una irradiación de 15 minutos.

Respuesta de células normales (CCD-986sk) a la irradiación con láser de 405 nm: (a) viabilidades de células de varios tiempos de irradiación (CTRL = control; (*p < 0,05 vs. CTRL; N = 5) y (b) desarrollo de temperatura durante el láser irradiación en la superficie de la suspensión CCD-986sk en medio DMEM.

La tinción de CV se utilizó para calcular la supervivencia bacteriana antes y después del tratamiento con láser para evaluar el impacto inhibidor de la luz láser de 405 nm en S. aureus. Como se representa en la Fig. 3a, la viabilidad bacteriana disminuyó un 26 % en 5 min (p < 0,05), un 59 % en 10 min (p < 0,001) y un 68 % en 15 min (p < 0,001), respectivamente. La temperatura máxima en la superficie del stent alcanzó los 37,5 °C (fig. 3b).

Inhibición de la biopelícula bacteriana después de la irradiación con láser de 405 nm: (a) viabilidad bacteriana después de la exposición a la luz láser de 405 nm en varios tiempos de irradiación (CTRL = control; *p < 0,05 y **p < 0,001 frente a CTRL; N = 5) y (b) desarrollo de temperatura durante la irradiación con láser en la superficie del stent uretral.

La figura 4a muestra la determinación de S. aureus en UFC después de la irradiación de 405 nm, y cada condición de tratamiento representa un número diferente de colonias (N = 10). Los resultados mostraron que la colonia total disminuyó después de la irradiación y se representó en log CFU/mL (reducción de 1,2 log, 2,2 log y 3,2 log durante 5, 10 y 15 min) (Fig. 4b). Aunque la inhibición máxima alcanzó una reducción logarítmica de 3,2 (p < 0,01) en 15 minutos de irradiación (270 J/cm2), la viabilidad de las células humanas (CCD-986sk) (Fig. 2a) bajo las mismas condiciones también disminuyó en más del 10 %. . Por lo tanto, la irradiación con láser de 10 minutos podría lograr la tasa de inhibición mínima (reducción logarítmica de 2 a 3) para prevenir la formación de biopelículas en EE. UU. con la dosis de tratamiento de seguridad.

Inhibición bacteriana de S. aureus después de la exposición de láser de 405 nm a varios tiempos de irradiación: (a) células bacterianas en placas de agar (CTRL = control) y (b) cuantificación de la eliminación bacteriana en log CFU/ml (*p < 0,05 y ** p < 0,01 frente a CTRL, N = 10).

La Figura 5a presenta los niveles de generación de ROS determinados por tinción con NBT, que se introdujo en la membrana celular. El resultado muestra que el NBT pudo detectar la generación de ROS en todas las condiciones tratadas. Los resultados de la generación de ROS fueron 21,7, 46,7 y 74,4 % (p < 0,05) durante 5, 10 y 15 min, respectivamente. De acuerdo con este resultado, una irradiación más prolongada del láser de 405 nm podría producir más ROS que afectaran la muerte celular. La Figura 5b demuestra el resultado de la actividad depuradora de los antioxidantes usando el ensayo DPPH. Los resultados demuestran que los radicales libres después de la producción de ROS aumentaron, según el tiempo de irradiación de la luz láser de 405 nm. Las condiciones de tratamiento (5, 10 y 15 min) alcanzaron 22 % (p < 0,05), 43 % (p < 0,001) y 62 % (p < 0,001) de actividad antioxidante en comparación con el control, respectivamente. El grupo de control (sin tratamiento con láser) mostró la capacidad antioxidante más pequeña, mientras que los grupos tratados produjeron capacidades antioxidantes crecientes con el aumento de las dosis de luz. El grupo bacteriano que recibió la mayor dosis de 15 min mostró un aumento estadísticamente significativo en la actividad secuestrante de DPPH (p < 0,05) en comparación con el control. La Figura 5c presenta la concentración de fuga de proteínas antes y después del tratamiento mediante el método de Lowry. La observación de la concentración de fuga de proteína en 5, 10 y 15 min alcanzó 37, 71 y 69 µg/mL, respectivamente. La mayor cantidad de fuga de proteínas después del tratamiento con láser se midió en 10 min de irradiación con láser y disminuyó en 15 min. La actividad de fuga de proteína alcanzó un estado estacionario después de 10 min de tratamiento porque la concentración de proteína cayó en 15 min de irradiación, en comparación con 10 min de irradiación con láser (p = 0,92). Estos hallazgos sugirieron que el láser de 405 nm podría aumentar la muerte bacteriana al hacer que las bacterias sufran un mayor estrés oxidativo y permitir que las proteínas se filtren fuera de la membrana bacteriana dañada.

Efecto de inhibición óptica de la luz láser de 405 nm contra S. aureus en el stent uretral: (a) generación de ROS durante el tratamiento, (b) actividad de eliminación de DPPH y (c) concentración de fuga de proteína usando el método de Lowry (*p < 0,05 y ** p < 0,001 frente a CTRL; ns = no significativo; N = 5), y (d) imágenes SEM de S. aureus después del tratamiento con láser (las flechas azul, naranja y roja representan una biopelícula gruesa, bacterias liberadas de la biopelícula y muerte bacteriana con daño morfológico (barra de escala = 2 µm; 20 kX y barra de escala de entrada = 20 µm; 2 kX).

La pérdida de integridad de la membrana de las biopelículas bacterianas expuestas a cuatro condiciones de tratamiento diferentes se muestra en SEM (Fig. 5d) e imágenes fluorescentes en la Fig. 6 (CTRL, 5, 10 y 15 min). Una proporción significativa de colonias bacterianas se ha convertido en una arquitectura de biopelícula gruesa hecha de materiales poliméricos extracelulares (flecha azul) en el control no tratado (Fig. 5d (CTRL)). Según la Fig. 5d (5 min), la luz láser de 405 nm destruyó la biopelícula y liberó la biopelícula en una sola célula (flecha naranja). Las colonias bacterianas en la biopelícula depositada en los EE. UU. mostraron la ausencia de una morfología de biopelícula intacta. En la Fig. 5d (10 y 15 min), algunas bacterias resultaron dañadas (flecha roja), lo que indica la muerte celular, y las bacterias se retiraron de los EE. UU.

Análisis de la integridad de la membrana bacteriana después del tratamiento con láser: (a) bacterias vivas teñidas con SYTO 9, (b) bacterias muertas teñidas con PI, (c) cuantificación de la intensidad de píxel para bacterias vivas (intensidad verde) y (d) cuantificación de píxel intensidad en bacterias muertas (intensidad roja) (**p < 0,001 frente a CTRL; ns = no significativo; N = 7; barra de escala = 100 µm; 40X).

La evaluación de imágenes fluorescentes indicó que la implementación de luz láser de 405 nm disminuyó significativamente la cantidad de células bacterianas con pocas membranas celulares intactas restantes. El SYTO 9 marcó la membrana intacta restante como bacterias vivas (color verde), y la población después del tratamiento fue menor que la del control (Fig. 6a). El yoduro de propidio (PI) demostró que el número de bacterias después del tratamiento fue mayor que el del control, lo que significa más daño a la membrana representado en color rojo después del tratamiento (Fig. 6b). La cuantificación de bacterias vivas (Fig. 6c) representadas en intensidad verde confirmó que la luz láser de 405 nm podría inhibir el biofilm bacteriano en US, lo que concuerda bien con los resultados de las imágenes SEM (62, 21 y 4% para 5, 10 , y 15 min (p < 0,001), respectivamente). La cuantificación de bacterias muertas validó que la luz láser de 405 nm podría inhibir las bacterias que obtuvieron mayor intensidad roja después de la exposición al láser de 405 nm (17, 68 y 98 % durante 5, 10 y 15 min, respectivamente) (Fig. 6d ).

El estudio actual intentó comprender el efecto de la luz láser de 405 nm contra el biofilm bacteriano desarrollado por EE. UU. El tratamiento con láser se utilizó como un intento de reemplazar o ayudar al uso de antibióticos para prevenir los efectos secundarios. Otro tratamiento para la prevención de las ITU es la extracción del stent, pero junto a ello, aún se presentan traumatismos y otros riesgos, como complicaciones urológicas mayores tras la extracción del stent y la obstrucción uretral24,25. Por lo tanto, el tratamiento alternativo, como la irradiación con láser, puede ser otra opción para prevenir las infecciones urinarias.

La luz láser de 405 nm tiene la capacidad de inhibir la formación de biopelículas bacterianas en los EE. UU. El mecanismo para inhibir la formación de biopelículas se basa en la generación de ROS, que puede afectar la desintegración de la membrana y la muerte celular26,27. Según un trabajo anterior28, las porfirinas endógenas de las células bacterianas absorbieron selectivamente la luz láser de 405 nm y produjeron las ROS intracelulares necesarias para matar eficazmente a las bacterias. Además, la presencia de ROS puede provocar la peroxidación de lípidos, la oxidación de proteínas y ácidos nucleicos y la inhibición de enzimas, todo lo cual puede destruir los microorganismos21. Juliano et al. informaron que un paciente típico sometido a un procedimiento urológico con urocultivo positivo tiene 103 colonias29. La reducción bacteriana del presente trabajo confirmó que la inhibición con luz láser de 405 nm podría reducir más de 3 log después de 15 min de exposición al láser con una irradiación de 0,3 W/cm2. Aunque la afección fue insignificantemente tóxica para las células normales (Fig. 2), aún debe confirmarse la dosis de seguridad para este tratamiento antes de las traducciones clínicas. Bauer et al. informó que los efectos citotóxicos se encontraron a 300 J/cm2 después de una exposición a láser de 405 nm30. Un ensayo de MTT realizado después de 15 min de irradiación con láser (270 J/cm2) también confirmó los efectos citotóxicos con una reducción de células de más del 10 %. Por lo tanto, la irradiación láser de 10 minutos de luz láser de 405 nm podría ser la dosis segura (180 J/cm2) con una reducción celular inferior al 10 % y una reducción logarítmica bacteriana de 2,2.

La generación de ROS después del tratamiento con láser de 405 nm se examinó mediante tinción con NBT, que interactúa con los iones superóxido para producir un precipitado de formazán intracelular púrpura/azul insoluble y estable31. La producción de ROS se ve afectada por el tiempo de exposición del láser de 405 nm a las bacterias. Cuanto más tiempo se aplica la exposición a la luz a las bacterias, más ROS se pueden detectar en cada condición. Además, la actividad de barrido afectada por ROS se llevó a cabo mediante el ensayo DPPH, que arrojó resultados similares a la generación de ROS después del tratamiento con láser. La capacidad del láser de 405 nm que interactúa con las bacterias para donar hidrógeno a DPPH y convertirlo en DPPH-H se considera una eficacia eliminadora de radicales libres. Este fenómeno resultó en una disminución en el valor de absorbancia después de que el color púrpura radical (DPPH) se cambiara al color amarillo (DPPH-H)32. Además, el efecto de la luz láser de 405 nm contra las células bacterianas se confirmó utilizando la estimación de la fuga de proteínas por el método de Lowry. Curiosamente, la concentración de fuga de proteína después del tratamiento aumentó, pero durante 15 minutos de irradiación, la concentración de proteína inicial disminuyó y resultó en una menor cantidad de liberación de proteína, posiblemente debido a la desintegración de las moléculas de proteína por la irradiación prolongada con láser. La mayor cantidad de concentración de proteína ocurrió en 10 min con 71 µg/mL. Dado que la proteína es un tipo de componente intracelular esencial33, la fuga de proteína se considera una indicación que incluye tanto la fuga citoplásmica como el daño de la capa lipídica34 y las membranas celulares35.

El efecto del láser de 405 nm en las células morfológicas dependió del tiempo de irradiación del láser de 405 nm, lo que resultó en la eliminación de biopelículas y daños celulares en 10 y 15 min. La estructura cambia del círculo perfecto al círculo reducido, causado por la desintegración de la membrana que se confirma con las imágenes SEM de las bacterias. Se cree que un criterio para determinar si las células bacterianas están vivas o muertas es la integridad celular y de la membrana. Se supone que las células vivas tienen las membranas celulares intactas y apretadas que son impermeables a algunas tinciones, mientras que se supone que las células muertas tienen las membranas rotas y/o dañadas36. La tinción SYTO 9 se une al ADN y al ARN y emite una fluorescencia verde, mientras que el PI solo puede entrar en las células con la membrana comprometida, que se une al ADN y al ARN y emite señales de fluorescencia roja37. La pérdida de integridad de la membrana después de 10 y 15 minutos de irradiación con láser tuvo una intensidad de píxel verde más baja y una intensidad de píxel rojo más alta en comparación con el control. Se confirmó que el láser de 405 nm provocó la desintegración de la membrana de las bacterias y emitió las señales de fluorescencia roja de las bacterias muertas después del tratamiento.

Para aplicaciones clínicas, se espera que el método propuesto se use en pacientes con UTI al insertar un dispositivo óptico integrado en una canasta en la uretra y colocarlo en los EE. UU. La fibra óptica difusora situada en el canal uretral puede irradiar luz láser de 405 nm sobre la superficie del US interno para prevenir o minimizar la formación de biopelícula bacteriana en el US con efectos fotoinhibidores. Por lo tanto, futuros trabajos deberían probar un modelo in vivo para explorar dosis clínicas y adaptar la dosis óptima a un canal uretral y tejidos periféricos. La tasa de inhibición mínima para eliminar 103 colonias podría ser diferente en condiciones de tiempo real. Por lo tanto, es necesario realizar experimentos en condiciones que puedan imitar el canal uretral. Además de convertirlo en uno de los tratamientos para la ITU en pacientes con stent, necesitamos aclarar y monitorear el efecto fotoinhibidor contra enfermedades urológicas, como la obstrucción uretral y la estenosis uretral. Por último, se debe realizar un estudio piloto para identificar y optimizar las condiciones del tratamiento clínico, como la potencia del láser, el tiempo de irradiación y el número y período de tratamiento, así como para validar la eficacia y seguridad de las traducciones clínicas.

En conclusión, el presente trabajo demostró la efectividad de una luz láser de 405 nm para la inhibición bacteriana en EE. UU. con una reducción bacteriana de 2 a 3 log y el margen de seguridad. La generación de ROS después de la exposición a la biopelícula con láser de 405 nm contribuyó a la fuga de proteínas, la desintegración de la membrana y la muerte celular afectada. Otros estudios examinarán la inhibición bacteriana simultánea usando el multibacteriano in vivo para mitigar el riesgo de UTI en pacientes con stent al reducir la presencia de resistencia bacteriana causada por el uso prolongado de antibióticos.

Se adquirieron ecografías estériles de UVENTA™ Urethral stent; TAEWOONG Medical, Corea del Sur. El US era autoexpandible, con 80 mm de longitud y 10 mm de diámetro, y consistía en una estructura metálica implantable de cobertura total fabricada con alambre de nitinol y recubierta de una fina capa de silicona (no biodegradable). S. aureus (KCTC 1916) del cultivo madre bacteriano (-80 °C) se colocó en una placa de agar y se inoculó durante 24 h. Luego, las bacterias se subcultivaron en caldo de soja tríptico (TSB) (50 mL) y se incubaron durante 24 h en una incubadora a 37 °C. Para determinar el número de colonias bacterianas se utilizó el método de McFarland38 para obtener 108 colonias en 10 mL. Inicialmente, se bombeó medio fresco (P1 = 1,5 mL/min) en un pequeño tubo de silicona (diámetro interior = 4 mm; diámetro exterior = 5 mm; Sungjin, Corea del Sur) con inyección de suspensión bacteriana (10 mL). Luego, la segunda bomba (P2 = 50 ml/min) se encendió cuando P1 drenó el medio por todo el tubo de silicona y se usó para drenar el medio de silicona más grande (diámetro interior = 10 mm; diámetro exterior = 12 mm; Sungjin, Corea del Sur) durante tres días. Se colocó un US en un tubo de silicona más grande y la silicona se colocó en un baño de agua a 37 °C. Posteriormente, el medio que se usó fluyó a otra botella. Se bombeó medio fresco cada 4 h con P1 para evitar que las bacterias crecieran y formaran una biopelícula uniforme en los EE. UU. Cabe señalar que el proceso actual se centró en el desarrollo de la biopelícula bacteriana en los EE. UU. in vitro, que difícilmente imita las condiciones clínicas. La figura 7A muestra la configuración. Después de ser cultivado durante tres días, los EE. UU. se tiñeron con cristal violeta (CV) para determinar si se formó biopelícula durante los días de cultivo, como se muestra en la Fig. 7b.

Ilustraciones esquemáticas de la preparación de bacterias: (a) cultivo bacteriano en stent uretral en condiciones dinámicas, (b) ejemplos de stent uretral antes (día 0) y después del cultivo, y (c) configuración de tratamiento con láser de 405 nm. (día 3; teñido con cristal violeta; TSB = medio de caldo de soja tríptico; SA = suspensión de S. aureus; WB = baño de agua; US = stent uretral; UM = medio usado; P1, P2 = bomba, S1 = silicona pequeña, S2 = silicona grande y DF = fibra difusora).

El dispositivo óptico integrado en la cesta utilizado en este estudio se adaptó modificando la forma de la cesta, el diámetro (10 mm) y la caracterización del material que se utilizó para el dispositivo de la cesta del trabajo anterior39. La canasta, que se integró con un difusor óptico, tiene como objetivo mantener la posición de la fibra difusora en el centro cuando se coloca en los EE. UU., de modo que la propagación de la luz pueda ser uniforme en todas las direcciones. Se utilizó luz azul (405 nm; láser CNI, Changchun, PR China) como fuente de luz con una irradiancia de 0,3 W/cm2. Las condiciones de tratamiento fueron variadas, dependiendo de los tiempos de irradiación de 5, 10 y 15 min. El control era una condición no tratada. Las fluencias correspondientes fueron 90, 180 y 270 J/cm2. Para el área de tratamiento, cortamos el stent en 10 mm de largo y expusimos la luz láser de 405 nm dentro del stent. Se desarrolló una configuración experimental colocando los EE. UU. cultivados en un soporte de pie, y luego se colocó un dispositivo integrado en la cesta en la misma dirección y se insertó en los EE. UU. en el centro. Se colocó una cámara infrarroja (FLIR A325, 320 × 240 píxeles, resolución = 25 μm, rango espectral = 7,5–13 μm; FLIR, Wilsonville, Oregón) a 30 cm sobre la superficie de los EE. UU. y se controló con una computadora personal para monitorear el desarrollo de la temperatura durante tratamiento (Fig. 7c).

El ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) se utilizó para evaluar la seguridad y toxicidad de la luz láser de 405 nm. . La línea celular CCD-986sk (obtenida del Korean Cell Line Bank) se utilizó como línea celular normal en todas las condiciones de tratamiento. Las células CCD-986sk se descongelaron en un baño de agua a 37 °C, se colocaron en un tubo cónico de 15 mL, se agregaron 3 mL de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Corning, NY, EE. UU.) y la suspensión se centrifugó a 1000 × g durante 5 min. Se eliminó el sobrenadante y las células se colocaron en una placa de cultivo con 10 ml de DMEM durante 48 h. El subcultivo celular se realizó cada dos o tres días para obtener una línea celular estable para el ensayo MTT. Las líneas celulares estables se contaron, se sembraron en placas de 24 pocillos y se incubaron durante 24 h para permitir que las células crecieran bien antes del tratamiento. Las células se trataron según las condiciones de tratamiento aplicadas a los EE. UU. (tiempos de irradiación: 5, 10 y 15 min) con una irradiancia de 0,3 W/cm2. Las células tratadas se incubaron durante 24 h. Después de la incubación, se retiró el medio, se añadió solución de MTT y se incubó durante 3 h en la oscuridad a 37 °C. La solución de MTT se eliminó, se reemplazó con sulfóxido de dimetilo (DMSO) y se incubó durante 15 min. La absorbancia se determinó espectrofotométricamente a 570 nm utilizando un lector de microplacas (Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.; N = 10 por condición).

Después del tratamiento, se usó la tinción de CV para estimar la viabilidad bacteriana lavando los EE. UU. con agua destilada e incubando durante 20 min en solución de CV. Posteriormente, se añadió una solución de solubilización (95% de etanol con 5% de agua destilada) y se sonicó durante 10 min. Las soluciones bacterianas se colocaron en una placa de 96 pocillos y se midió su absorbancia a 570 nm utilizando un lector de microplacas (Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.; N = 10 por condición). Además, la viabilidad bacteriana se calculó en términos de unidades formadoras de colonias (UFC). Se lavaron diez milímetros de US con 1 mL de agua destilada y se colocaron en un tubo cónico de 15 mL. Se sometió a ultrasonidos durante 10 min y se sometió a agitación vorticial durante 5 min. A continuación, la suspensión bacteriana se diluyó diez veces y se esparcieron 100 μL de la suspensión en una placa de agar de soja tríptico (TSA) y se incubó durante 24 ha 37 °C. Después de la incubación, las placas de agar se analizaron con OpenCFU40 para calcular el número de colonias bacterianas, que está representado por el número logarítmico de la viabilidad bacteriana en la superficie de EE. UU. de 10 mm (UFC/mL, N = 10 por condición).

Para investigar el mecanismo dominante del tratamiento propuesto, tanto el control como el US tratado se colocaron en un tubo cónico de 15 ml con 1 ml de agua destilada, se sonicaron durante 20 min y se sometieron a agitación vorticial durante 5 min para separar las bacterias en el US. Se añadió al tubo una solución de 1 mg de nitro azul tetrazolio (NBT) y se incubó durante 30 min en la oscuridad. Después de agregar HCl 0,1 M a la solución para inhibir la interacción bacteriana con NBT, todos los tubos se centrifugaron a 12 000 × g durante 5 min. Para liberar las ROS intercelulares, los gránulos se trataron primero con 800 ml de solución salina y 400 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Para estimar la generación de ROS, se colocaron 200 μL de cada muestra en una placa de 96 pocillos y se midieron a 575 nm (N = 5 por condición). La generación de ROS recolectada se normalizó mediante la absorbancia de las muestras de control para excluir cualquier error experimental causado por el procedimiento de sonicación. Se utilizó la siguiente ecuación para determinar el nivel de amplificación de ROS intercelular (Ri):

donde Ac es la absorbancia del control y At es la absorbancia de la muestra tratada.

El 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) es un radical libre estable que se utiliza para evaluar las capacidades generales de eliminación de radicales de varios antioxidantes después de la generación de ROS. Los ensayos de DPPH se realizaron añadiendo la solución de DPPH (40 µg/mL de metanol) a las células de control y tratadas e incubando durante 30 min en la oscuridad. Se usó un espectrofotómetro UV para detectar la absorbancia a 517 nm y el experimento se repitió cinco veces. Se utilizó una curva de inhibición de dosis logarítmica para obtener el valor IC50 del estándar41, que es la concentración del estándar necesaria para inhibir el 50% del radical libre DPPH. La menor absorbancia de la mezcla de reacción sugirió el aumento de la actividad de los radicales libres. Se usó la siguiente ecuación para calcular el porcentaje del efecto de eliminación de DPPH (Ds).

donde Ac es la absorbancia del control y At es la absorbancia de la muestra tratada.

El método descrito por Lowry et al. (1951) para evaluar la proteína liberada por las células de S. aureus (106 CFU/mL) antes y después del tratamiento con luz láser de 405 nm durante 24 h. La absorbancia se midió espectrofotométricamente a 660 nm. La cantidad de proteína liberada se determinó extrapolando una ecuación de la curva de calibración usando albúmina de suero bovino (BSA), como se describió previamente42.

Para evaluar la arquitectura de formación de biopelículas, los US control y tratados se lavaron varias veces con agua destilada y se fijaron con glutaraldehído al 2,5 % con pH 7,5 durante 4 h a temperatura ambiente (26 °C). Después de la incubación, los EE. UU. se lavaron con etanol al 100 % y se dejaron secar a temperatura ambiente. Los ultrasonidos de control y tratados se cortaron en pedazos pequeños (5 mm) y se cubrieron con oro-paladio para el análisis SEM.

Se utilizó un kit de viabilidad bacteriana LIVE/DEAD BacLight (Bio Probes, Eugene, OR, EE. UU.) para evaluar las bacterias vivas y muertas en función de la integridad de la membrana de los stents de control y tratados. La suspensión bacteriana de la ecografía de control y tratada se centrifugó a 1000 rpm durante 5 min para recoger la biopelícula bacteriana adherida al stent. A continuación, se añadieron colorantes SYTO 9 y yoduro de propidio (PI) a una concentración de 1:1 y se incubaron durante 15 min. Después de la incubación, se añadió 1 μL de suspensión a un portaobjetos de vidrio y se cubrió con un cubreobjetos bajo un microscopio de fluorescencia. Las bacterias vivas y muertas se representan en verde y rojo, respectivamente. Se realizó un análisis cuantitativo de las imágenes de fluorescencia utilizando el número total de intensidades de píxeles verdes y rojos y calculando los valores RGB con Image J (Instituto Nacional de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.).

Los datos se representan como la media y la desviación estándar en cuatro condiciones: una como control y otras tres condiciones de tratamiento (tiempos de irradiación: 5, 10 y 15 min). Cada condición (control y tratamiento) se repitió cinco veces (N = 5). El análisis de CFU se realizó en 10 repeticiones para asegurar datos apropiados. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para evaluar todas las condiciones comparando las condiciones de control y tipo. Para el análisis estadístico se utilizó SPSS (SPSS, Chicago, EE. UU.), y se consideró estadísticamente significativo p < 0,05.

Este artículo no contiene ningún estudio con participantes humanos realizado por ninguno de los autores.

Todos los datos relevantes utilizados para respaldar los hallazgos de este estudio se incluyen en el artículo. Información y datos adicionales están disponibles del autor (LM; [email protected]) previa solicitud razonable.

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Los autores desean agradecer a la Dra. Sirajunnisa Abdul Razack, investigadora postdoctoral en el Centro de Tecnología Biomédica Integrada Marina, Institutos Nacionales de Investigación Clave en Universidades, Universidad Nacional Pukyong, Busan, Corea, por su guía técnica de análisis en este estudio.

Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (No. 2021R1A2C2003733) y el Programa de Investigación de Ciencias Básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Ministerio de Educación (Nº 2021R1A6A1A03039211).

Industria 4.0 Convergencia Biónica Ingeniería, Universidad Nacional Pukyong, Busan, Corea

Luluil Maknuna, Van Nam Tran y Hyun Wook Kang

Centro de Tecnología Biomédica Integrada Marina, Institutos Nacionales de Investigación Clave en Universidades, Universidad Nacional Pukyong, Busan, Corea

Luluil Maknuna y Hyun Wook Kang

División de Salud Inteligente, Facultad de Tecnología de la Información y Convergencia, Universidad Nacional Pukyong, Busan, Corea

Byeong-Il Lee y Hyun Wook Kang

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad Nacional Pukyong, Busan, 48513, República de Corea

Hyun Wook Kang

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LM, VNT y HWK concibieron y diseñaron la investigación. LM y VNT realizaron el experimento. LM analizó los datos y escribió el manuscrito. BL realizó análisis de datos, manuscrito revisado y apoyó la financiación. HWK supervisó el estudio, revisó el manuscrito y aprobó la versión final. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Hyun Wook Kang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Maknuna, L., Tran, VN, Lee, BI. et al. Efecto inhibitorio de la luz láser de 405 nm sobre el biofilm bacteriano en el stent uretral. Informe científico 13, 3908 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30280-0

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Recibido: 28 de septiembre de 2022

Aceptado: 20 febrero 2023

Publicado: 08 marzo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30280-0

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