como un ultravioleta

Este artículo analiza los conceptos básicos de diseño de un espectrómetro de microscopio de rango UV-visible-NIR en varias configuraciones diferentes. Estos incluyen configuraciones para adquirir espectros de absorbancia, reflectancia, fluorescencia y Raman de muestras microscópicas. También se incluye un breve resumen de algunos de los usos del microscopio-espectrómetro.

El microscopio-espectrómetro es un instrumento con guión que combina el poder de aumento de un microscopio con las capacidades analíticas de diferentes tipos de espectrómetros. Como tales, estos instrumentos se utilizan para adquirir espectros, espacios de color e incluso espesores de película delgada de áreas de muestras a escala micrométrica.

Con la flexibilidad inherente a su diseño, el microscopio-espectrómetro puede configurarse de muchas maneras diferentes y usarse para medir espectros de absorbancia, reflectancia, Raman e incluso emisión, como fluorescencia y fotoluminiscencia, de áreas de muestra de tamaño submicrónico. Con la adición de algoritmos especializados, el microscopio-espectrómetro también se puede utilizar para medir el espesor de películas delgadas o para actuar como colorímetro para muestras microscópicas.

Hay muchas razones para utilizar herramientas que puedan adquirir espectros de áreas de muestras microscópicas. Estos instrumentos requieren solo pequeñas cantidades de muestras en forma sólida o líquida. Otra ventaja es que se requiere muy poca o ninguna preparación para muchas muestras. Además, las comparaciones de color realizadas por espectroscopia tienden a ser más precisas porque estos instrumentos tienen un rango espectral más amplio, pueden corregir las variaciones de iluminación y pueden medir la intensidad de cada banda de luz de longitud de onda.

Antes del advenimiento de la microespectroscopia, la única forma de analizar muchos tipos de muestras microscópicas era utilizar pruebas microquímicas y luego algún tipo de examen visual. Desafortunadamente, esta prueba tiende a ser destructiva, requiere un volumen considerable de muestra y sufre las imprecisiones del sistema visual humano. El microscopio-espectrómetro evita estos problemas y mejora la precisión y la velocidad del análisis. Los espectrómetros de microscopio también pueden "ver" más allá del alcance del ojo humano y, por lo tanto, distinguir variaciones que no serían evidentes visualmente.

El microscopio-espectrómetro integra espectrómetros de rango UV-visible-NIR con un microscopio óptico diseñado tanto para espectroscopia como para imágenes (consulte la Figura 1). El microscopio debe presentar un rango espectral operativo desde el ultravioleta profundo hasta el infrarrojo cercano, manteniendo una buena calidad espectral y de imagen. No se pueden utilizar microscopios estándar, ya que solo cubren una parte del espectro visible debido a sus diseños ópticos y fuentes de luz utilizadas en dichos dispositivos.

Un microscopio espectrómetro de rango UV-visible-NIR, por otro lado, utiliza un microscopio hecho a medida con una óptica y fuentes de luz optimizadas para el UV profundo a través del NIR. El microscopio consta de lentes montadas en aire de sílice fundida y otros materiales, así como espejos ultravioleta mejorados, montados en una configuración diseñada para iluminar uniformemente una muestra mientras produce una imagen nítida en todas las regiones del rango espectral designado del instrumento. Según el tipo de espectroscopia que se vaya a realizar, la iluminación se proporciona mezclando la salida de una lámpara de deuterio con la de una lámpara halógena, utilizando lámparas de arco o incluso láseres. Las ventajas de construir este tipo de microscopio UV-visible-NIR es que tanto la calidad de la imagen, en todas las regiones UV, visible y NIR, como la calidad espectral pueden optimizarse cuando el microscopio está integrado con sus componentes de imagen y espectroscopia. .

El propio espectrómetro también debe estar diseñado para microespectroscopia con el fin de obtener buenos resultados espectrales. Esto significa que el espectrómetro debe ser muy sensible y al mismo tiempo mantener una resolución espectral y una relación señal/ruido aceptables. La estabilidad también es un problema ya que el microscopio-espectrómetro es un instrumento de un solo haz y se deben obtener espectros de referencia antes de medir la muestra. El instrumento también debe tener un alto rango dinámico, ya que con frecuencia se cambia de microespectroscopia de transmisión o reflectancia a microespectroscopia de fluorescencia. Esto permite al usuario obtener diferentes tipos de información espectral desde exactamente la misma ubicación en la muestra microscópica.

La integración del espectrofotómetro con el microscopio es de vital importancia. Si bien tanto el microscopio como el espectrofotómetro deben optimizarse para la microespectroscopia, la clave para el funcionamiento de un espectrofotómetro de microscopio es el hardware que les permite trabajar juntos. Esta interfaz tiene varios requisitos básicos. Lo que es más importante, debe canalizar la energía electromagnética recolectada por el microscopio de la muestra hacia el espectrofotómetro.

Sin embargo, el usuario debe poder visualizar el área de medición de la muestra así como los alrededores. Esto se logra teniendo la apertura de entrada del espectrofotómetro en el mismo plano focal que la imagen de muestra. A continuación, la muestra se puede mover con la platina del microscopio, como se haría normalmente con un microscopio, hasta que la imagen de la abertura de entrada esté sobre el área a medir. El cuadrado negro en el centro de la imagen es la apertura de entrada del espectrofotómetro. Todo esto se hace en tiempo real para que la espectroscopia de las muestras al microscopio sea rápida y sencilla.

El trabajo del microscopio UV-Visible-NIR es iluminar la muestra y luego canalizar la energía electromagnética recolectada de la muestra hacia el espectrómetro. Para hacer esto, el usuario debe poder visualizar el área a medir, así como ver la muestra circundante. Esto se logra teniendo la apertura de entrada del espectrómetro en el mismo plano focal que la imagen de muestra. Por lo tanto, una imagen de video de los dos muestra la apertura en un enfoque nítido sobre la muestra además del campo de visión circundante de la muestra. En funcionamiento, la platina de muestra se mueve hasta que la imagen de la abertura de entrada está sobre el área de la muestra a medir. Cuando la apertura se coloca sobre el área de interés de la muestra, se mide el espectro. Por supuesto, también se pueden capturar imágenes de la muestra medida con la apertura colocada. Para muchas aplicaciones de investigación, esta operación de alineación de la apertura de la muestra se realiza manualmente. Para las operaciones industriales, este procedimiento suele estar automatizado.

El camino óptico de un microscopio-espectrómetro es más complejo que la operación. Consulte la Figura 2. La óptica del microscopio enfoca la luz sobre la muestra. Los fotones interactúan con las moléculas de la muestra y el objetivo del microscopio recoge la energía electromagnética de la muestra y la enfoca en la apertura de entrada del espectrómetro. Gran parte de la luz es reflejada por una cámara digital que permite al usuario ver tanto la muestra como la apertura de entrada del espectrofotómetro superpuestas, lo que permite al usuario ver exactamente lo que está midiendo. La energía electromagnética que pasa a través de la apertura de entrada pasa al espectrómetro y se recoge un espectro. Dependiendo del tipo de experimento a realizar, el microscopio se puede configurar con diferentes esquemas de iluminación: la luz blanca permite la microespectroscopía de reflectancia desde el UV profundo hasta el NIR. La iluminación incidente también se puede utilizar para la microespectroscopia de fluorescencia o fotoluminiscencia mediante el uso de un monocromador basado en filtros con una fuente de lámpara de arco o uno de una serie de láseres.

La microespectroscopia de transmisión se realiza con una luz blanca enfocada en la muestra a través del condensador del microscopio. Como se indicó anteriormente, los materiales ópticos y las fuentes de luz utilizadas para construir el microscopio significan que el rango espectral tanto para la obtención de imágenes como para la espectroscopia llega hasta los 200 nm y en el infrarrojo cercano hasta los 2500 nm. De manera comparable, un microscopio óptico moderno tendrá un rango espectral muy limitado de solo 450 a 700 nm dependiendo de su configuración. Por lo tanto, la necesidad de un microscopio personalizado si el usuario requiere espectros ultravioleta o infrarrojo cercano.

La microespectroscopia Raman también se puede realizar con el espectrómetro de microscopio. El módulo Raman integra un láser, un espectrómetro Raman y una óptica para la iluminación de la muestra y la recogida de la luz dispersada Raman. Consulte la Figura 3. Una vez más, este módulo también está diseñado para simplificar la operación al tiempo que brinda al usuario capacidades espectroscópicas Raman confocal. Cuando se usa, el láser del módulo Raman ilumina la muestra. La luz dispersada Raman se recoge de la muestra mediante los objetivos del microscopio y se refleja de nuevo en la apertura de entrada del espectrómetro Raman. A continuación, se recopila un espectro Raman de un área de muestra específica.

El espectrómetro de microscopio se utiliza en muchos campos y aplicaciones diferentes. En las ciencias de los materiales, estos instrumentos se utilizan para desarrollar y caracterizar nuevos materiales. La industria de las pantallas los usa para caracterizar píxeles individuales para la consistencia del color (consulte la Figura 4).

En semiconductores, se utilizan para medir el espesor de películas delgadas (consulte la Figura 5). El biólogo usa espectrómetros de microscopio para estudiar la visión y el científico forense los usa para caracterizar rastros de evidencia, como fibras textiles y pedacitos de pintura.

El microscopio-espectrómetro es un dispositivo que integra un microscopio óptico con un espectrómetro para adquirir espectros de áreas de muestras microscópicas. Dichos instrumentos son capaces de medir espectros de absorbancia y reflectancia desde el ultravioleta profundo hasta las regiones visibles e infrarrojas cercanas. El espectrómetro de microscopio también puede medir espectros de fluorescencia, fotoluminiscencia y Raman. Estos dispositivos se utilizan en muchos campos, incluidos, entre otros, la ciencia forense, las mediciones de espesor de películas delgadas ópticas y de semiconductores, la biotecnología y la investigación científica de materiales de vanguardia.

Este artículo fue escrito por Paul Martin, presidente de CRAIC Technologies, para obtener más información, visite aquí o envíele un correo electrónico a Paul. Esta dirección de correo electrónico está protegida contra spambots. Necesita tener Javascript activado para verlo..

Este artículo apareció por primera vez en la edición de enero de 2023 de la revista Photonics & Imaging Technology.

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