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Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 11935 (2022) Citar este artículo

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Los métodos basados en la irradiación ultravioleta (UV) utilizados para la inactivación viral han brindado una vía importante para combatir el virus del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus-2 (SARS-CoV-2). Un problema importante con la tecnología de inactivación UV de última generación es que se basa en lámparas UV, que tienen una eficiencia limitada, requieren alta potencia, grandes dosis y largos tiempos de irradiación. Estos inconvenientes limitan el uso de lámparas UV en sistemas de filtrado de aire y otras aplicaciones. Para abordar estas limitaciones, aquí informamos sobre la fabricación de un dispositivo que comprende un láser UV de 266 nm de nanosegundos pulsado acoplado a una cavidad integradora (LIC) compuesta de un material reflectante UV, politetrafluoroetileno. Las cavidades de inactivación de lámparas UV anteriores se basaban en paredes pulidas con reflejos especulares, pero los IC UV reflectantes difusos no se exploraron a fondo para la inactivación de virus. Nuestros resultados muestran que el dispositivo LIC puede inactivar varios virus respiratorios, incluido el SARS-CoV-2, con un tiempo de irradiación efectivo de ~ 1 ms, con una eficiencia superior a > 2 órdenes de magnitud en comparación con las lámparas UV. La mejora demostrada de la cavidad de 3 órdenes de magnitud en relación con la exposición directa es crucial para el desarrollo de sistemas eficientes de purificación de agua y aire UV en tiempo real. Hasta donde sabemos, esta es la primera demostración de la aplicación LIC para una amplia inactivación viral con alta eficiencia.

Para combatir el brote de la pandemia mundial del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus-2 (SARS-CoV-2), se han desarrollado varios nanomateriales con propiedades físicas y químicas ajustables para la vacunación y el tratamiento de pacientes1,2. Además, los purificadores de aire asistidos por oxidación fotoelectroquímica se desarrollaron como herramientas potenciales para controlar la exposición interior al SARS-CoV-23. Sin embargo, los virus pandémicos se propagan a través del aire y las superficies y, por lo tanto, existe una gran necesidad de desarrollar métodos rápidos y eficientes para inactivar las partículas virales en las superficies y en el aire, especialmente en lugares públicos como hospitales, aeropuertos, tiendas, etc. pandemia y posibles futuras pandemias.

Actualmente se validan diversos protocolos de desinfección mediada por luz para muestras de superficie, aire y agua, así como equipos de protección personal4. La radiación ultravioleta como método eficaz y sin contacto para la inactivación de patógenos virales se ha utilizado durante mucho tiempo, principalmente en forma de lámparas de mercurio de baja presión o diodos emisores de luz5,6,7,8. La luz UVC (en el rango de 100 a 280 nm) tiene la mayor eficiencia de inactivación antimicrobiana y antiviral entre los diversos rangos de UV, incluidos UVA (315 a 400 nm) y UVB (280 a 315 nm)9. La absorción máxima de ácidos nucleicos es de ~ 265 nm, con luz UVC que causa daño al inducir la fusión fotoquímica de dos pirimidinas adyacentes en dímeros unidos covalentemente, entrecruzamiento de proteína de ARN y daño molecular específico del sitio10. La radiación UV se ha explorado para el tratamiento de enterovirus humanos, Zika, hepatitis E, dengue, Nilo Occidental y otros11,12,13,14,15,16,17,18,19 y, recientemente, para SARS-CoV-220 ,21,22,23,24,25,26,27,28. La eficacia virucida de la luz ultravioleta está influenciada por una serie de factores, incluidos el patógeno objetivo, el entorno y el material que se descontamina29. Además, la UV germicida se ha combinado con el tratamiento térmico para la desinfección viral30,31, incluido el SARS-CoV-232. Los problemas con las lámparas UV incluyen una eficiencia limitada, que requiere alta potencia y largos tiempos de irradiación (grandes dosis), lo que requiere mucho tiempo y no es adecuado para su uso en muchos sistemas de aire acondicionado, donde el aire pasa por una lámpara UV solo por períodos muy cortos. de tiempo. Los inconvenientes del calentamiento incluyen baja eficiencia y grandes pérdidas de calor al medio ambiente, que requieren esfuerzos de enfriamiento adicionales y, por lo tanto, aumentan el costo de la inactivación.

Además, se informó que los pulsos de láser ultracortos en el visible (Vis) a 425 nm y en el infrarrojo cercano (NIR) a ~ 800 nm inactivan los virus33,34,35. Se sugirió que la dispersión Raman estimulada por impulsos, que da como resultado la agregación de las proteínas de la cápside viral, es el principal mecanismo de inactivación33. Sin embargo, la eficiencia de inactivación de la irradiación Vis-NIR pulsada es menor que la de las lámparas UVC germicidas. Los láseres UVB pulsados, como el láser excimer de nanosegundos de 308 nm, también se utilizaron para la inactivación viral, pero mostraron una eficiencia baja, similar a Vis-NIR36. Se obtuvieron altas eficiencias utilizando láseres UVC pulsados como excimer de 193 nm y cuarto armónico Nd:YAG de 266 nm37,38. La irradiación con láser UV pulsado de nanosegundos de 266 nm reveló el mecanismo no lineal de dos cuantos del entrecruzamiento de la proteína de ARN en la inactivación del virus de la encefalomielitis equina venezolana (EEV) con un aumento de más de un orden de magnitud del rendimiento cuántico en comparación con la lámpara UVC de 254 nm38. Esto contrasta con la naturaleza lineal de un fotón del mecanismo de formación de dímero de pirimidina convencional que está presente tanto en la irradiación con láser UV pulsado como con lámpara UV. La ablación con láser UV pulsado se basa en una combinación de varios mecanismos, incluida la descomposición térmica y fotoquímica, que puede aumentar la eficiencia de la inactivación viral más allá de las lámparas UV convencionales. Los pulsos UV contienen más energía por unidad de tiempo y pueden penetrar las soluciones más que la luz UV continua37. Por otro lado, los pulsos UV corresponden a una absorción más fuerte que los pulsos Vis o NIR, lo que resulta en una inactivación más efectiva.

La absorción de luz se puede mejorar acoplando láseres UV pulsados a cavidades de integración (CI). Los circuitos integrados típicos tienen geometría esférica y paredes hechas de materiales de dispersión difusa altamente reflectantes39,40. La dispersión de luz lambertiana desde las paredes genera campos uniformes dentro de los circuitos integrados y grandes longitudes de camino óptico efectivo, que se han utilizado para aplicaciones espectroscópicas y de detección41,42,43,44. Aunque anteriormente se han utilizado varias cajas y cavidades UV para la inactivación de patógenos45, las propiedades virucidas de los IC no se han explorado mucho. La naturaleza de dispersión difusa de los circuitos integrados tiene una ventaja sobre la dispersión especular de las cavidades convencionales al proporcionar una gama más amplia de ángulos de iluminación que pueden reducir la protección de los virus por parte de las micropartículas. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el láser UV pulsado acoplado a los circuitos integrados puede destruir el virus de manera más eficiente en un tiempo reducido. Para probar esta hipótesis, desarrollamos aquí un nuevo dispositivo de inactivación de virus basado en un láser UV pulsado de nanosegundos de 266 nm acoplado a una cavidad de integración, denominado Dispositivo de Cavidad de Integración Láser (LICD). Examinamos la inactivación de los coronavirus humanos, como el SARS-CoV-246 y el coronavirus 229E (HCoV-229E)47, así como el virus respiratorio sincitial (RSV)48. Nuestros resultados muestran que LICD puede inactivar el 99,9 % del virus con una irradiación total efectiva de ~ 1 ms, lo que representa un aumento de la eficiencia de > 3 órdenes de magnitud. Hasta donde sabemos, esta es la primera demostración del uso de una cavidad de integración de láser UVC pulsado para la inactivación del coronavirus humano, incluido el SARS-CoV-2.

Se investigaron dos métodos diferentes de exposición al láser: (1) una exposición directa del virus al rayo láser UV (Fig. 1a); (2) una exposición indirecta del virus a la radiación láser UV cuando se coloca en un lugar aleatorio dentro del recinto LICD (Fig. 1b). Diseñamos el LICD acoplando el láser UVC pulsado de nanosegundos de 266 nm a una carcasa cilíndrica de circuito integrado hecha de un revestimiento de politetrafluoroetileno (PTFE) altamente reflectante de UV49,50. Los esquemas detallados y las dimensiones espaciales de LICD se muestran en la Figura S1. Para la exposición directa, se colocó un vial de plástico horizontalmente como se muestra en la Fig. 1a y se sostuvo una gota de virus en el fondo del vial. Para la exposición LICD, un vial se colocó al azar en la parte inferior y el segundo vial se colocó al azar en la pared lateral del recinto como se muestra en la Fig. 1c.

Inactivación de virus mediante cavidad integradora de láser UVC ultrarrápido. ( a ) Esquema de la exposición directa del láser UVC pulsado en una gota de solución de virus en un vial. ( b ) Esquema de la exposición LICD de la irradiación láser UVC en una gota de virus colocada dentro de la cavidad en la ubicación de la apertura a2. (c) Fotografía de la cavidad con una gota de virus dentro de un vial. ( d ) Fotografía de la cavidad llena con luz láser UVC y el reflejo de la fluorescencia del segundo paso y la dispersión multipaso como dos puntos brillantes en una tarjeta blanca, colocada en la apertura a2. ( e ) Imagen de altura AFM de la lámina de PTFE utilizada como pared de cavidad LICD reflectante difusa. ( f, g ) Imágenes de altura AFM de los viriones HCoV-229E no tratados (U) y tratados con láser UVC (T). La barra de escala es de 0,3 µm. ( h ) Altura y ancho promedio de los viriones HCoV-229E tratados y no tratados.

Después de que el rayo láser incidente se refleja desde la pared interior del recinto, la luz difusamente dispersa experimenta múltiples reflejos, llenando uniformemente todo el volumen. La eficiencia de dispersión difusa se puede estimar observando el brillo de los dos puntos de fluorescencia en una tarjeta blanca colocada en la abertura de salida de la cavidad (Fig. 1d). El punto del segundo paso se refleja directamente desde la pared de la cavidad por el rayo láser incidente. El punto de la dispersión multipaso tiene un brillo similar, lo que indica una alta reflectividad difusa de las paredes de la cavidad. El revestimiento de PTFE tiene una reflectividad difusa omnidireccional de > 93 % debido a la estructura porosa.

Investigamos las propiedades morfológicas de las paredes de IC utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). La figura 1e muestra la imagen de altura AFM de la lámina de PTFE utilizada como material reflectante para el IC. Las irregularidades observadas se deben a la presencia de nanopartículas y poros que se destacan mediante líneas discontinuas blancas en la Figura S2a. El análisis AFM en la Figura S2b mostró un tamaño de partícula promedio de 0,44 µm y un tamaño de poro promedio de 1,86 µm. Los perfiles AFM de una partícula típica y un poro se muestran en las Figuras S2c y S2d, respectivamente. Para observar los cambios morfológicos causados por la exposición al láser UVC pulsado, realizamos mediciones de AFM en los viriones HCoV-229E no tratados (no irradiados) y tratados (irradiados por láser UVC pulsado directo) (Fig. 1f, g). El virus tratado se irradió durante 30 min. Se eligió el tratamiento de 30 min para asegurar la inactivación completa (más del 99,99 %, véase más adelante). Para el análisis estadístico, se seleccionaron diez viriones de muestras tratadas y no tratadas. La altura promedio de los viriones no tratados fue de ~ 31 nm, mientras que los viriones tratados tenían una altura promedio de ~ 19 nm (Fig. 1h). Los perfiles de ancho lateral mostraron el ancho promedio de los viriones no tratados ~ 159 nm y de los viriones tratados ~ 82 nm (Fig. 1h).

Los perfiles de altura de AFM de los ejemplos típicos de los viriones no tratados y tratados se muestran en las Figuras S3a y S3b. Estos resultados indican la contracción de las partículas virales después de la exposición a pulsos ultracortos de láser UVC, lo que confirma la contribución del mecanismo de ablación a la inactivación del virus.

Para investigar la inactivación del coronavirus, utilizamos una exposición directa al láser UVC de nanosegundos de 266 nm para inactivar el virus HCoV-229E. Se colocó una gota de virus de 6 μl en PBS en un vial como se describe anteriormente. Los tiempos de irradiación láser de 1, 5, 10 y 30 s corresponden a las dosis de 3,5, 17,6, 35,3 y 105,9 mJ/cm2. Tras la exposición directa del láser UVC, la replicación de HCoV-229E se inactivó por completo (reducción del 99,9 %) después de 4 s de exposición, lo que corresponde a una dosis de 15,6 ± 0,3 mJ/cm2, medida mediante qPCR para el pico de 229E (S) (Figura S4a) y transcripciones de nucleocápside (N) (Fig. 2a) después de 72 h de infección en células Calu-3. Para investigar los efectos de la exposición indirecta al láser UVC en la replicación viral dentro del recinto del IC, realizamos la exposición LICD de la gota del virus HCoV-229E en PBS colocado dentro de un vial en dos posiciones aleatorias dentro del IC (que se muestra en la Figura S1) con los tiempos de irradiación de 10, 30, 120 y 1800s, que corresponden a dosis de 0,05, 0,15, 0,6 y 9 mJ/cm2, respectivamente. Después de la dosis de UV de 0,63 ± 0,02 mJ/cm2, la replicación viral de HCoV-229E se inactivó (99,9% de reducción), cuando se midió por qPCR para las proteínas 229E S (Figura S4b) y N (Fig. 2b) después de 72 h de infección en Células Calu-3 (Figura S5).

El virus HCoV-229E se expuso a láser UVC pulsado directo (a) y cavidad (b) durante los tiempos indicados. Las células Calu-3 se trataron 24 h después de la siembra con los grupos indicados de 229E (3 MOI). A las 72 h posteriores a la infección, se extrajo el ARN y se realizó qPCR. Se muestra el cambio de pliegue promedio ± SEM, en comparación con el control negativo (NC) (N = 3). Se usó un ANOVA de 1 vía y una prueba post hoc de Dunnett para determinar la significación en comparación con 0 s. Supervivencia de HCoV-229E en función del tiempo de irradiación UV a través de la exposición directa (c) y la cavidad (d). *p < 0,05, **p < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

La Figura 2c muestra el gráfico de supervivencia log-lineal de la cinética de inactivación directa, donde N0 y N son las concentraciones inicial y final de las unidades virales infecciosas determinadas a partir del análisis de qPCR. Solo la parte lineal del gráfico se ajustó de acuerdo con el enfoque común51 como se describe en la sección Métodos. El ajuste de regresión lineal dio como resultado la constante de velocidad de inactivación k = 0,443 ± 0,006 mJ/cm2. La figura 2d muestra la gráfica de supervivencia LICD y el ajuste de regresión lineal con la constante de tasa de inactivación k = 10,9 ± 0,4 mJ/cm2. Estos resultados indican que tanto la exposición directa como la LICD al láser UVC pulsado erradican la capacidad viral para replicarse en las células huésped. Sin embargo, el LICD es un orden de magnitud más efectivo ya que requiere una dosis más baja para lograr una inactivación similar.

A continuación, realizamos una exposición directa del láser UVC de nanosegundos de 266 nm para inactivar el SARS-CoV-2. Utilizamos una gota de virus de 23 μl en PBS colocada en un vial para las exposiciones directa y LICD como se describe anteriormente. Los tiempos de irradiación de 30, 60, 120 y 300 s corresponden a dosis de 105,9, 211,8, 423,6 y 1059 mJ/cm2, respectivamente. Tras la exposición directa al láser UVC, la replicación del SARS-CoV-2 se inactivó (99,9 %) después de 3 min y una dosis de exposición de 715 mJ/cm2, medida mediante microscopía fluorescente (Fig. 3a–d) y qPCR para SARS-CoV-2 Proteínas S (Figura S6a) y N (Fig. 3i) después de 48 h de infección en células Calu-3. Luego realizamos la exposición LICD de SARS-CoV-2 con los tiempos de irradiación de 30, 60, 120 y 300 s correspondientes a dosis de exposición de 0,15, 0,3, 0,6 y 1,5 mJ/cm2, respectivamente. Después de la dosis de UV de 0,60 ± 0,02 mJ/cm2, se inactivó la replicación viral (reducción del 99,9 %) cuando se midió mediante microscopía fluorescente (Fig. 3e-h) y qPCR para SARS-CoV-2 S (Figura S6b) y N ( Fig. 3j) transcripciones después de 48 h de infección en células Calu-3. La infección por SARS-CoV-2 suele provocar un aumento patológico de la proteína inflamatoria TNF-α46. Sin embargo, después de la exposición a la irradiación láser UVC directa (Fig. 3k) y LICD (Fig. 3l), la infección por SARS-CoV-2 causa una expresión de TNF-α significativamente menor en las células Calu-3. El análisis de regresión lineal de la curva de supervivencia para la exposición directa en la Fig. 3m dio como resultado la constante de tasa de inactivación de k = 0,00965 ± 0,00004 mJ/cm2. El ajuste de regresión lineal para el LICD en la Fig. 3n dio como resultado una constante de tasa de inactivación de k = 11,2 ± 0,1 mJ/cm2. Esto mostró que LICD era tres órdenes de magnitud más eficiente que la exposición directa.

El virus SARS-CoV-2 se expuso a los tiempos de irradiación indicados de luz láser UVC directa o de cavidad. Las células Calu-3 se infectaron 24 h después de la siembra con los grupos indicados de CoV-2 (0,1 MOI). ( a – h ) Las imágenes se tomaron 48 h después de la infección con el microscopio EVOS (Thermo Fisher). 200X. Barra de escala = 200 μm. ( i – j ) Expresión de la proteína SARS-CoV-2 N en células Calu-3. A las 72 h posteriores a la infección, se extrajo el ARN y se realizó qPCR. Se muestra el cambio de pliegue promedio ± SEM, en comparación con el control negativo (NC) (N = 3). Se usó un ANOVA de 1 vía y una prueba post hoc de Dunnett para determinar la significación en comparación con 0 s. ( k – l ) Expresión de marcadores inflamatorios en células Calu-3 después de la infección por SARS-CoV-2. Para el control negativo, el CoV-2 se expuso a la luz UVC con una varilla de mano durante 2 min. A las 48 h posteriores a la infección, se extrajo el ARN y se realizó qPCR. Se muestra el cambio de pliegue promedio ± SEM, en comparación con el control negativo (NC) (N = 3). Se usó un ANOVA de 1 vía y una prueba post hoc de Dunnett para determinar la significación en comparación con 0 s. Supervivencia del SARS-CoV-2 en función del tiempo de irradiación a través de la exposición directa (m) y la cavidad (n). *p < 0,05, **p < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

A continuación, usamos el sobrenadante del cultivo celular Calu-3 del experimento anterior para reinfectar un nuevo lote de células Calu-3 con SARS-CoV-2. El sobrenadante del cultivo celular que contenía el virus SARS-CoV-2 se expuso al láser directo o LICD para inactivar el virus. Los tiempos de irradiación del láser fueron de 60 y 120 s con dosis de 211,8 y 423,6 mJ/cm2 para exposición directa y de 0,3 y 0,6 mJ/cm2 para LICD. Tras la exposición directa al láser UVC, la replicación del SARS-CoV-2 se inactivó por completo a una dosis de 211,8 mJ/cm2, medida mediante microscopía fluorescente (Fig. 4a-c) y qPCR para la transcripción del SARS-CoV-2N (Fig. 4e) después de 48 h de infección en células Calu-3. Después de la dosis de UV de 0,6 mJ/cm2, la replicación viral se inactivó en LICD, cuando se midió con microscopía de fluorescencia (Fig. 4d) y qPCR para transcripciones de SARS-CoV-2N (Fig. 4f) después de 48 h de infección en Calu-3 células. Estos resultados muestran que después de la exposición al láser UVC pulsado directo o LICD, las muestras de coronavirus, incluido el SARS-CoV-2, ya no pueden causar una infección productiva en células cultivadas.

Reinfección de células Calu-3 con sobrenadante de cultivo de células Calu-3 infectadas con SARS-CoV-2 que se expusieron a luz láser UVC directa o de cavidad (Fig. 3). ( a - d ) Las imágenes se tomaron 48 h después de la infección con un microscopio EVOS (Thermo Fisher). 200X. Barra de escala = 200 μm. ( e – f ) Expresión de la proteína SARS-CoV-2 N en células Calu-3. A las 48 h posteriores a la infección, se extrajo el ARN y se realizó qPCR. Se muestra el cambio de pliegue promedio ± SEM, en comparación con el control negativo (NC) (N = 3). Se usó un ANOVA de 1 vía y una prueba post hoc de Dunnett para determinar la significación en comparación con 0 s. *p < 0,05, **p < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Para probar LICD en un virus respiratorio diferente, a continuación expusimos el virus RSV que expresa proteína roja fluorescente (RSV-RFP) a un láser UV pulsado directo de nanosegundos de 266 nm con tiempos de irradiación de 1, 5 y 15 s con dosis correspondientes de 3.5, 17.6 y 52.9 mJ/cm2 (Figuras S7a-h). Una dosis de 17,6 mJ/cm2 dio como resultado una inactivación viral completa en las células Hep2 a las 72 h después de la infección cuando se observó mediante microscopía de fluorescencia. Luego, el virus RSV-RFP se expuso al LICD, que inactivó con éxito RSV-RFP en células Hep-2 a las 72 h de la infección cuando se expuso a dosis tan pequeñas como 0,3 mJ/cm2; sin embargo, una dosis de 0,05 mJ/cm2 también inactivó la mayor parte del virus (Figuras S7i-p).

Como medida de control, también expusimos directamente el virus RSV-RFP a un láser UVB de nanosegundos pulsado de 337 nm (Figura S8). La irradiación con láser UVB no tuvo efecto inhibitorio sobre la replicación viral RSV-RFP en células Hep-2. Estos resultados confirman el uso de radiación láser pulsada UVC para la inactivación viral. Realizamos mediciones de control adicionales utilizando dos fuentes de lámpara UVC diferentes para la inactivación viral, la unidad Stratalinker (Figura S9) y una varita de mano (Figura S10). Ambas lámparas UVC fueron capaces de inactivar la replicación viral RSV-RFP en células Hep2 a las 72 h post-infección con un tiempo de irradiación de 5 s y una dosis de 68,5 mJ/cm2, cuando se observaron mediante microscopía de fluorescencia. Sin embargo, se obtuvo una eficiencia de inactivación dos órdenes de magnitud superior utilizando el LICD (dosis de 0,6 mJ/cm2, Tabla 1).

La Tabla 1 presenta los resultados del análisis de regresión lineal de la cinética de inactivación de HCoV-229E y SARS-CoV-2. Las constantes de velocidad de inactivación k se obtuvieron a partir de las curvas de supervivencia descritas en la sección Métodos. La Tabla 1 también muestra la dosis de UVC necesaria para inactivar el 90 % (D90), el 99 % (D99) y el 99,9 % (D99,9). D99.9 representa la "inactivación completa" que requiere 715 mJ/cm2 para el SARS-CoV-2 usando la exposición directa, mientras que solo 0,6 mJ/cm2 usando el LICD. Esta diferencia se cuantifica como el factor de mejora de la cavidad (EF) de 1160 (Tabla 1) dado por la ecuación EF en la sección Métodos.

La inactivación completa (99,9 %) de HCoV-229E requirió 15,6 mJ/cm2 para la exposición directa, mientras que solo se necesitaron 0,63 mJ/cm2 usando el LICD (Tabla 1), lo que resultó en una FE de 25 debido a la cavidad. La constante de tasa de inactivación para LICD de k = 10,9 mJ/cm2 fue similar a la del SARS-CoV-2 para LICD. Sin embargo, se obtuvo una constante de velocidad mayor de k = 0,44 mJ/cm2 para la exposición UVC pulsada directa de HCoV-229E en comparación con k = 0,01 mJ/cm2 para SARS-CoV-2. Esta diferencia podría atribuirse a un tamaño de gota más pequeño (6 μl) y diferencias estructurales y morfológicas.

La constante de velocidad de inactivación obtenida para la exposición LICD k = 11,2 mJ/cm2 es más de un orden de magnitud mayor que las constantes de velocidad observadas anteriormente para la mayoría de los virus ssRNA que utilizan lámparas UVC a 254 nm y ~ 5 veces mayor que la prevista para el SARS-CoV -251. Por otro lado, el k = 0,01 mJ/cm2 observado para la exposición directa es un orden de magnitud inferior a los valores típicos de la literatura para otros virus ssRNA que utilizan lámparas de 254 nm. Esta diferencia podría explicarse por las diferentes condiciones experimentales, como el tamaño de gota relativamente grande de la solución de SARS-CoV-2 (23 μl) y la ausencia de agitación. Estos efectos podrían provocar una atenuación de la luz en la muestra y valores de k más bajos. Tenga en cuenta que estos efectos, sin embargo, no afectan los valores de EF, que muestran el aumento de la eficiencia de inactivación debido al efecto IC.

Una diferencia importante entre la lámpara UVC y la exposición a un láser UVC pulsado desde el punto de vista de las aplicaciones es el tiempo de irradiación efectivo, que es mucho más corto para el láser pulsado. La duración total de la exposición al láser por unidad de tiempo puede obtenerse multiplicando la duración del pulso de nanosegundos por la tasa de repetición del pulso. Esto da como resultado un tiempo de irradiación total efectivo para inactivar los coronavirus HCoV-229E y SARS-CoV-2 de ~ 1 ms usando LICD, mientras que solo ~ 0,1 ms para inactivar RSV. Se requieren tiempos de inactivación similares para la exposición directa pero con dosis mayores debido a la diferencia de las áreas de iluminación de la directa (~ 0,2 cm2) en comparación con la LICD (~ 200 cm2). Debido a las diferencias en la organización del genoma y la composición de las proteínas no estructurales, estos tres virus nos permiten demostrar la capacidad de inactivación de amplio rango del láser UVC pulsado y LICD.

En estos estudios, realizamos una inactivación rápida de virus utilizando un láser UVC pulsado de nanosegundos de 266 nm para desarrollar un dispositivo LIC antiviral amplio. Para probar este novedoso sistema, utilizamos 3 tipos diferentes de virus, incluidos HCoV-229E, RSV-RFP y SARS-CoV-2. Una comparación del LICD, fabricado con PTFE, un material de dispersión difuso de alta radiación ultravioleta, con la exposición directa del rayo láser UVC, demostró una inactivación viral eficiente después de la exposición al LICD. El tiempo necesario para la inactivación podría reducirse aún más aumentando la potencia del láser, utilizando elementos ópticos adicionales y mejorando las propiedades de reflexión difusa del dispositivo con materiales reflectantes más avanzados. Además, más allá de la inactivación viral, la aplicación de LICD puede extenderse a otros patógenos como bacterias52,53,54 y moho55. Se prevé que el progreso tecnológico en el desarrollo de láseres UV reduzca el costo y haga que la tecnología LICD esté ampliamente disponible en un futuro cercano. La aplicación de LICD a los sistemas de purificación de aire y agua se beneficiará de la mayor eficiencia de inactivación. Los acondicionadores de aire basados en LICD se pueden usar en espacios cerrados como aviones, tiendas y oficinas. Los sistemas de purificación de agua basados en LICD se pueden usar en entornos domésticos e industriales. Las tuberías de agua recubiertas de PTFE serían útiles junto con sus propiedades antiincrustantes para el tratamiento de aguas residuales56.

El LICD se puede utilizar en lugares públicos debido a la protección cerrada del volumen expuesto UVC por la cavidad. En general, la exposición de la piel a la radiación UVC puede causar daño oxidativo ya sea por la absorción directa de UV o por las especies reactivas de oxígeno57. Sin embargo, se ha informado que las dosis bajas de luz UVC lejana (207–222 nm) pueden ser inofensivas para los tejidos humanos expuestos7. Además, las nanopartículas de aluminio se propusieron como agentes protectores en un enfoque médico cuántico basado en la radiación UV para disminuir significativamente el riesgo de fotodaño de los tejidos sanos, mientras se inactivan los patógenos58.

Las líneas celulares (Calu3 y Hep2) se adquirieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Virginia, EE. UU.) y se sometieron a pases no más de 25 veces. Las células se cultivaron en una incubadora humidificada a 37 °C en una atmósfera de CO2 (dióxido de carbono) al 5 %. Las células se cultivaron en placas tratadas con cultivo de tejidos en los medios de cultivo celular completos apropiados [HEP2 = DMEM (GE Healthcare) que contenían 10 % de suero bovino fetal (FBS) (Atlanta Biologicals) y 1 % de penicilina/estreptomicina (GE Healthcare)] [Calu3 = MEM (GE Healthcare) que contiene 20 % de FBS, 1 % de aminoácidos no esenciales (GE Healthcare), 1 % de piruvato de sodio 100 mM (Gibco) y 1 % de penicilina/estreptomicina].

En estos experimentos se utilizaron tres virus diferentes. Proteína roja fluorescente (RFP) que expresa el virus respiratorio sincitial (RSV-RFP), el coronavirus humano 229E (HCoV-229E) y el SARS-CoV-2. HCoV-229E se obtuvo a través de BEI Resources, NIAID, NIH: Human Coronavirus, 229E, NR-52726. El SARS-CoV-2 nos lo proporcionó el Dr. Pei-Yong Shi de la Rama Médica de la Universidad de Texas, Galveston, TX, EE. UU.59. La cepa de RSV utilizada en todos los experimentos (RSV-RFP) fue una cepa A2 recombinante que expresaba un marcador fluorescente rojo, mKate2, así como la proteína F de la cepa clínica Línea 19 (rA2-KL19F). La manipulación y el almacenamiento de RSV-RFP y HCoV-229E, incluidos todos los procedimientos experimentales, se realizaron en un laboratorio de bioseguridad de nivel 2 (BSL-2). La manipulación, el almacenamiento y los experimentos con SARS-CoV-2 se realizaron en un laboratorio BSL-3. Para todos los experimentos, se infectó una monocapa de células Hep2 (RSV-RFP) o Calu3 (SARS-CoV-2 y HCoV-229E) con una confluencia del 80 % con varias concentraciones del MOI del virus indicado (como se indica en las leyendas de las figuras). Luego, las células se incubaron con el inóculo viral en Opti-MEM (Life Technologies) durante 2 horas a 37 °C. Después de esto, el medio infeccioso se reemplazó por medio de crecimiento fresco. Se usó microscopía fluorescente (Keyence BZ-X800 o EVOS) para obtener imágenes de las células y luego se recogieron los sedimentos celulares para el análisis de ARN.

El ARN celular total se extrajo de sedimentos celulares usando Trizol (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN se cuantificó utilizando Nanodrop (Thermo Fisher Scientific). A continuación, se transcribió inversamente un microgramo de ARN utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc Maxima (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La qPCR realizada en el cDNA se usó para cuantificar los niveles de expresión relativos de ciertos genes a la β-actina como control. El análisis en tiempo real se realizó utilizando BlazeTaq SYBR Green qPCR Mix 2.0 (Genecoepia), según el protocolo del fabricante, en un termociclador Bio Rad CFX-384 utilizando cebadores obtenidos de Integrated DNA Technologies (IDT). Los datos se analizaron utilizando cálculos de ΔΔCt y la expresión de todos los genes se normalizó a la expresión de β-actina como gen de mantenimiento. A continuación, se calculó el cambio medio de veces ± SEM, en comparación con el control. El análisis de datos se realizó utilizando el software CFX Maestro (Bio-Rad).

Construimos la cavidad de integración (IC) de forma cilíndrica utilizando una lámina de PTFE poroso de alta reflectancia (Thorlabs) de 0,75 mm de espesor que mostró una reflectancia UVC de > 93 %. Los diagramas esquemáticos y las dimensiones espaciales se muestran en la Figura S1.

El aumento del camino óptico en el IC se puede estimar utilizando el enfoque de Fry, et al.39,42. La distancia promedio entre reflexiones dentro de una cavidad integradora \(\overline{d }\) = 4.1 cm está dada por \(\overline{d }\) = 4\(\frac{V}{S}\), donde V es el volumen de la cavidad y S es el área superficial. La longitud de trayectoria promedio dentro del IC, L = 63 cm, se calculó mediante L = 4\(\frac{V}{S(1-\rho )}\), donde \(\rho\) = 0,935 es la reflectividad del IC estimado a partir de la reflectividad del PTFE a 266 nm. El factor de mejora de la cavidad (EF) para cada virus se calculó mediante EF = \(\frac{{k}_{cavity}}{{k}_{direct}}\), donde \({k}_{direct} \) y \({k}_{cavity}\) es la constante de tasa de inactivación para la exposición directa y LICD, que se describe a continuación.

Se utilizaron las siguientes fuentes de UV: (i) La fuente de UVC pulsada fue un láser pulsado de nanosegundos Nd:YAG de 266 nm (JDS Uniphase NanoLaser™) con una potencia media de 1 mW, una duración de pulso temporal de ~ 1 ns y una tasa de repetición de 10 kHz. (ii) La fuente de UVB pulsada era un láser de nitrógeno de 337 nm (VSL-337ND) con una potencia media de 5,2 mW, una duración temporal del pulso <4 ns y una tasa de repetición de 10 Hz. (iii) La lámpara Cw UVC (Stratalinker® UV Crosslinker 1800) tenía 5 bombillas, 8 W cada una, con una longitud de onda de 254 nm. (iv) La lámpara Cw UVC (Handheld Wand, Clear-Raze™) tenía una bombilla de 18 W con una longitud de onda de 254 nm.

Los resultados de los experimentos de inactivación se analizaron utilizando los datos de expresión génica relativa de qPCR (Figs. 2 y 3). Los parámetros de regresión lineal de la Tabla 1 se calcularon utilizando la cinética de primer orden dada por ln(N/N0) = −k D, donde N/N0 es la fracción de supervivencia, N es la expresión génica relativa en cada dosis de UV (D), y N0 es la expresión génica relativa a dosis cero. Los experimentos se realizaron en 3 repeticiones para HCoV-229E y 4 repeticiones para SARS-CoV-2. La constante de tasa de inactivación, k (mJ/cm2), se calculó para cada cepa de virus y para exposiciones directas y LICD. Las dosis de reducción de carga para inactivar el 90 % (D90), el 99 % (D99) y el 99,9 % (D99,9) del virus están dadas por, D90 = \(\frac{-\mathrm{ln}[1-0,9] {k}\), D99 = \(\frac{-\mathrm{ln}[1-0.99]}{k}\), y D99.9 = \(\frac{-\mathrm{ln}[1 -0.999]}{k}\).

Las gotas virales se inactivaron con formalina tamponada con fosfato al 10 % durante 20 minutos y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las mediciones de microscopía de fuerza atómica (AFM) (OmegaScopeR, Horiba Scientific) se realizaron utilizando una punta de Si (Micromash) en el modo de tapping con una distancia promedio de muestra de punta de 20 nm en el virus depositado en sustrato de SiO2/Si por fundición. Se eligió un área de escaneo de 2 µm x 2 µm para AFM, que comprendía varios viriones, de los cuales se seleccionaron 10 viriones para calcular y comparar la altura y el ancho de los viriones tratados y no tratados.

Los experimentos se han repetido tres veces con tres repeticiones en cada experimento. Al comparar varios grupos, la significación estadística de cada experimento se determinó mediante el análisis de varianza (ANOVA) y la prueba post hoc de Dunnett, *p < 0,05, **p < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0.0001. Se realizaron cálculos y se produjeron gráficos utilizando el software Prism 6.0 (GraphPad). Los gráficos de resultados muestran la media y las barras de error representan la media más o menos el error estándar de la media.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles a pedido del autor correspondiente.

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Este trabajo cuenta con el apoyo parcial de un Premio científico de carrera de investigación sénior para SSM (IK6BX006032) y un Premio de científico de carrera de investigación para SM (IK6BX004212) y los Premios de revisión al mérito de asuntos de veteranos para SSM (BX003685) y SM (BX005490 y BX003413). Aunque este informe se basa en el trabajo respaldado, en parte, por el Departamento de Asuntos de Veteranos, la Administración de Salud de Veteranos, la Oficina de Investigación y Desarrollo, el contenido de este informe no representa las opiniones del Departamento de Asuntos de Veteranos ni del Gobierno de los Estados Unidos. . Además, este trabajo cuenta con el apoyo parcial de la Beca de desarrollo de la Universidad del Sur de Florida para DVV y las becas PRRN-Rapid COVID para SSM y SM.

Estos autores contribuyeron por igual: Sharad Ambardar, Mark C. Howell y Karthick Mayilsamy.

Departamento de Ingeniería Médica, Universidad del Sur de Florida, USF Cherry Drive ISA 6049, Tampa, FL, 33620, EE. UU.

Sharad Ambardar y Dmitri V. Voronin

Departamento de Asuntos de Veteranos, Hospital de Veteranos James A. Haley, Tampa, FL, 33612, EE. UU.

Mark C. Howell Jr, Andrew McGill, Ryan Green, Subhra Mohapatra y Shyam S. Mohapatra

Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina Morsani, Universidad del Sur de Florida, 12901 Bruce B Downs Blvd. MDC 2511, Tampa, Florida, 33612, EE. UU.

Mark C. Howell Jr, Andrew McGill, Ryan Green y Shyam S. Mohapatra

Departamento de Medicina Molecular, Facultad de Medicina Morsani, Universidad del Sur de Florida, 12901 Bruce B Downs Blvd. MDC 2525, Tampa, Florida, 33612, EE. UU.

Karthick Mayilsamy, Andrew McGill y Subhra Mohapatra

Departamento de Física, Universidad del Sur de Florida, Tampa, FL, 33612, EE. UU.

Dmitri V. Voronine

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Búsqueda de literatura y análisis de datos: SA, MCH, RG, ARM, KM Estudios de láser y cavidades: SA, MCH, RG, KM, RG, SM, SSM y DVV Análisis de inactivación viral: SA, MCH, RG, KM, SM, DVV y SSM Escribieron el manuscrito: SA, MCH, RG, ARM, RD, SM, DVV y SSM Ilustración de la figura: SA, MCH, KM, ARM, SM, DVV y SSM Todos los autores leyeron y aceptaron la versión publicada del manuscrito .

Correspondencia a Subhra Mohapatra, Dmitri V. Voronine o Shyam S. Mohapatra.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Ambardar, S., Howell, MC, Mayilsamy, K. et al. Dispositivo de cavidad de integración de láser UV ultrarrápido para la inactivación del SARS-CoV-2 y otros virus. Informe científico 12, 11935 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13670-8

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Recibido: 28 enero 2022

Aceptado: 26 de mayo de 2022

Publicado: 13 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13670-8

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